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先进的基因编辑工具CRISPR-Cas

越来越多的科学家开始对CRISPR-Cas系统进行研究。许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因,从而证明了这个技术的广泛适用性。CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话,有可能会广泛应用于小鼠,大鼠及其他模式动物的制备和研究中,成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充如今,CRISPR-Cas系统已经逐渐成为科学家们的新宠。

CRISPR-Cas

CRISPR-Cas工作原理

CRISPR 指的是规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。CRISPR/Cas是在大多数细菌和古细菌中发现的一种天然免疫系统,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。Sigma CRISPRs利用可定制的RNA-核酸酶复合物来实现哺乳动物基因组特定位点的编辑。

在细菌中,来自入侵病毒的短DNA序列(间隔区)被掺入CRISPR位点,充当之前感染的“记忆”。再次感染引发互补的成熟CRISPR RNA(crRNA)找到匹配的序列,为CRISPR相关(Cas)核酸酶在特定DNA序列切割双链提供了特异性。

Cas9 是由crRNA和tracrRNA(反式激活crRNA)引导、切割特定DNA序列的核酸酶。引导RNA(gRNA)可设计成包含发夹结构,以模拟 tracrRNA-crRNA复合物。结合特异性是根据gRNA和三核苷酸NGG序列(protospacer adjacent motif,PAM)。对于位点特异的编辑,CRISPR/Cas9系统至少需要Cas9核酸酶和gRNA。

消除脱靶效应

今年6月,美国麻省总医院的科学家J. Keith Joung博士发现CRISPR-Cas RGN也存在重大的局限性,它会在基因组的非目标位置产生非必要的DNA突变,也就是脱靶效应(off-target effect)。

为了减弱甚至消除脱靶效应,科学家提出了不同的方案。

美国麻省理工学院的张峰教授的研究团队认为有两种方式可以提高序列靶向特异性。第一种就是利用计算机模型。第二种方法就是调整导向RNA序列的量。在一般情况下,减小RNA序列的量可以减弱脱靶效应,但是不利于目的基因的裂解。对于每一个序列来说,高目标效应和低脱靶效应间存在一个最优的平衡点,这是可以计算出来的。

哈佛医学院的George Church研究小组生成了一系列的Cas9突变体,这些Cas9突变体没有生成双链断裂,而是引入了偏移缺口,每个缺口只影响一条DNA链。尽管这一策略实质上造成了双链断裂,它通常不会导致非同源末端连接(双链断裂的一种细胞修复机制)引起的插入或删除。因此,这种方法可能会减少脱靶效应。

引发科研狂潮

如今,被NCBI(美国国立生物技术信息中心)收录的关于CRISPR-Cas的文章已有201篇。就在上个月,中国科研人员就CRISPR-Cas展开研究,在Nature子刊上连发三篇文章。

中国科学院遗传与发育生物学研究所的高彩霞教授发表的文章是阐述利用CRISPR-Cas修改农作物的基因组。利用CRISPR,她的团队成功地令大米的4 种基因失去功能,这意味着该技术可以用于改良大米这种重要的农作物。(文章名:Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system)。至于小麦,科研人员剔除了一种基因,使小麦获得了白粉病抗性。

上海市调控生物学重点实验室、华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀教授和李大力副教授课题组则将该技术运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。研究发现:RNA注射的方式将CRISPR-Cas系统导入小鼠受精卵比DNA注射能更有效的在胚胎中产生定点突变;该方法无小鼠遗传品系的限制,能够对大片段的基因组DNA进行删除;同时注射针对不同基因的RNA序列能够在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变。此外,课题组利用CRISPR-Cas技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因(肥胖相关G蛋白偶联受体Mc4R)突变大鼠具有一致的表型。而中国科学院动物研究所的周琪博士发表的文章也是关于运用CRISPR-Cas技术到大鼠模型的构建的。

成本低廉

CRISPR的使用成本很低:免费的软件使得设计向导RNA(用于针对特定的基因)的成本为零,另外只需花费65美元便可以从名为Addgene的基因资源库中获取基因,来设计自己的CRISPR系统。自今年开始,Addgene(共有11个科研小组为它提供了可用于CRISPR系统的DNA序列)已经见证了5000种 CRISPR构造的产生。今年7月,Addgene在一周内就收到了(为了设计一种新构造的)100份订单,Addgene的执行董事Joanne Kamens说:“Addgene正在热卖中。”

8月底,Sigma-Aldrich公司也宣布推出Sigma CRISPRs,一款经济的哺乳动物基因组编辑工具,适合筛选和探索性研究。这是继锌指核酸酶(ZFN)以来,Sigma推出的第二款基因组编辑工具。

Sigma CRISPRs以单个质粒载体提供,其中包含GFP,可快速富集编辑过的细胞。当然,您也可以利用专门的生物信息学工具在线定制。

Sigma独有的在线设计工具让用户可根据CRISPR/Cas靶定的要求,识别人、小鼠和大鼠外显子中的最佳靶位点。它能够自动应用CRISPR/Cas最佳设计实践,包括靶位点与基因组中其他位点至少要求3个碱基对不匹配,从而最大限度减少了脱靶效应。

“Sigma 在2008年开发出CompoZr ZFN技术,如今ZFN已成为基因组编辑的金标准。我们利用这一专长创造出Sigma CRISPRs,它让研究人员以更快、更经济的方式筛选目的基因。在利用Sigma CRISPRs 鉴定出重要靶点之后,可通过超特异的CompoZr ZFNs 来验证生物学上相关的突变,以减少潜在的脱靶,”Sigma Life Science功能基因组学市场部经理Shawn Shafer博士谈道。

Sigma-Aldrich研发部门的首席研究员Greg Davis博士认为:“操控哺乳动物基因组的能力对生物学而言是革命性的。Sigma CRISPR/Cas技术作为一款早期、经济的基因编辑工具,为开发和使用带来巨大希望。”

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