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可用作植物转基因的遗传转化方法

植物遗传转化方法就是通过特定的方式将外源基因导入到受体细胞内,使之发生定向的、永久的遗传变异。目前,已经建立了多种转化系统。对大多数遗传转化系统而言,遗传转化方法是遗传转化系统的关键环节,决定着转化的成败及效率。用于植物的转化方法有许多:农杆菌介导法,基因枪法,电击法、PEG 法等。

在转基因植物中,用农杆菌介导法获得的转基因植物占80%,但大多集中在双子叶植物上;自从基因枪问世以来,单子叶植物中的禾谷类作物的遗传转化发展迅速。农杆菌介导法和基因枪法已成为目前用于遗传转化的主要方法。

农杆菌转化法

农杆菌包括引起植物冠瘿瘤的根癌农杆菌和引起发根病的发根农杆菌。根癌农杆菌和发根农杆菌有相似的遗传背景,在农杆菌介导的转化中,80%左右是由根癌农杆菌介导的,大约20%是由发根农杆菌介导的,这里主要介绍根癌农杆菌介导的转化。

根癌农杆菌Ti质粒上有一段转移DNA(T-DNA)和Vir 区,在农杆菌侵染植物时这段T-DNA 可以插入到植物基因组中,使其携带的基因在植物中得以表达。Vir 区共24 个基因,它们表达的蛋白与T-DNA 的加工和转移有关。

1985年,Horsch 首创叶盘法(leaf disk method),拓宽了受体的取材范围,大大简化了农杆菌的转化操作,是一种简便、可靠的遗传转化方法。由于T-DNA能进行高频率的转移,而且在Ti质粒中可插入大到50kb的外源基因,因此Ti质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。

农杆菌侵染植物是两个连续的过程,农杆菌通过伤口和宿主细胞接触,并有效地附着结合到宿主细胞上,然后受伤的植物细胞通过分泌和释放一种可扩散的诱导物,活化Vir基因,诱导其顺次表达,进而实现对T-DNA的酶切、环切、复制、运载并插入寄主细胞的基因组中。植物被成功转化的关键在于:(1) 农杆菌能否吸附到植物细胞壁上;(2)植物能否释放诱导Vir区基因表达的信号分子;(3)植物感受态细胞是否存在。

农杆菌法在植物遗传转化中的应用

过去认为受农杆菌宿主范围限制,农杆菌介导的遗传转化仅限于双子叶植物。农杆菌转化玉米首先是Grimsly在1987年将玉米条斑病毒的 cDNA 克隆至质粒上,用农杆菌侵染的方法将玉米条斑病毒的cDNA 导入玉米,使植株表现了系统感染症状,这个报导有力的证明了农杆菌能够侵染玉米。随着载体系统和转化方法的改进,农杆菌介导的遗传转化不再局限于双子叶植物,在一些单子叶植物如水稻、玉米、小麦等重要的农作物上也相继获得成功。

进入90 年代后,农杆菌转化法在水稻、玉米等重要的农作物上取得突破性进展。首先是1991年Gould 和Shen等利用农杆菌转化玉米茎尖分生组织获得转基因植株。1998 年Lupotto 也实现了农杆菌转化玉米的成功,Southern 杂交分析结果显示外源基因稳定遗传到下一代。

基因枪转化法

1987 年美国康奈尔大学的Sanford 等人首先发明了火药式基因枪。基因枪法又称微弹轰击法,它是通过一定的装置(火药或气流或高压放电)加速包被外源DNA 的金属颗粒(钨、金粉等)使其穿过细胞壁和膜而进入受体细胞, 可非特异地将外源基因导入植物的细胞、组织和器官。

气动式基因枪中具有代表性的是PDS-1000/He,利用由不同厚度的聚苯四甲酰亚胺膜制成的可裂圆片来调控氦气压力(450~2200P)。当氦气压力达到可裂圆片的临界承受压力时,可裂圆片破裂并产生强烈的气流,使微弹载体携带微弹高速运动,遇到刚性的阻挡网,微弹载体被阻遏,而微弹利用惯性继续向前高速运动,轰击靶细胞或组织。基因枪法不再受到受体基因型的限制,又能避开原生质体再生的障碍,从而使植物的遗传转化翻开了新的一页。

基因枪方法在植物遗传转化中的应用

应用基因枪转化最早的是Klein 等人在1987将携带有细菌氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的烟草花叶病毒的RNA 导入洋葱的表皮细胞,使此基因得到表达。后来,随着对物理参数(如金属粒子的理化特性、DNA 与金属粒子的结合和靶组织特性等)、环境条件(如受体植株、外植体和靶组织所适宜的温度、湿度和光照等)和生物因子(如外植体及其轰击前后的培养条件等)进行技术优化,不断完善的基因枪转化技术能实现对许多受体材料进行转化,包括原生质体、悬浮细胞系、愈伤组织、外植体(幼穗、幼胚或成熟胚),甚至可以直接轰击花粉。

1990年Gordon-Kamm 等用基因枪将GUS 基因和pat 选择抗性基因导入玉米悬浮细胞系,获得了正常可育的转基因植株。1993 年Koziel 等将苏云金杆菌CryⅡ(b)毒素蛋白基因的编码序列,分别与CaMV35S 启动子和玉米多种组织特异启动子组合连接,用基因枪法转化玉米幼胚,获得了高水平表达的抗虫玉米,而且能够稳定遗传。1994 年,Register 等将玉米花粉特异表达启动子或花药绒毡层特异表达启动子驱动的UidA 基因和CaMV35S 启动子驱动的NptⅡ、Bar 或筛选基因,连接到质粒,用基因枪转化玉米胚性悬浮细胞,获得了遵循孟德尔遗传规律的转化后代。目前,研究者仍在对基因枪转化的方法进行优化。

基因枪法的优点是无宿主限制,受体类型广泛,操作迅速、简单,能有效地转化质体。由于取材广泛,金属微粒的喷射面广,转化频率高,所以具有广泛的应用前景。缺点是转化的DNA片段太大时DNA 片段容易断裂,基因枪转化过程中,同源序列可能通过DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA 的相互作用,导致转录或转录后水平的基因沉默。另外,外源DNA往往成簇地整合到受体基因组中,而且可能以多种方式发生重排,所以转化体中的外源基因常常是多拷贝的。但对于这些不足,目前也有研究者在研究其机理并寻求解决办法。

其他遗传转化方法

电击法 电击法基本原理是电脉冲使细胞膜产生可逆性的“微孔”,外源DNA 可通过这些微孔进入受体细胞原生质体内。

1985年Fromm 等用电击法将pat 基因导入了玉米原生质体,得到了该基因稳定表达的愈伤组织。随着玉米原生质体再生技术的研究取得进展,1988年Rhodes 等用电击法转化玉米原生质体,首次获得了完整的转基因植株。电击法还可以对幼胚、愈伤组织和胚性悬浮细胞系进行遗传转化。1992年D’Hallum K 等以玉米幼胚和愈伤组织为受体,用电击法导入neo基因,获得了可育的转基因植株,而且neo 基因能稳定地遗传给后代。1993年Sukhapinda 等用电击法转化从玉米花粉愈伤组织分离的原生质体,将gusA和nptⅡ转入原生质体,获得单倍体转化植株。1994年Laursen 等以果胶降解酶处理悬浮细胞系后,通过电击法导入bar 基因,也获得了可育的转基因玉米。

电击法操作简单,不受宿主限制,在遗传转化技术研究的初期得到了较为广泛的应用,但是它的转化效率较低,而且对有壁细胞或组织的转化效果较差。

PEG 其基本原理是在二价阳离子(Mg2+、Ca2+等)存在的情况下PEG 能够有效地诱导DNA 产生颗粒状沉淀,从而使细胞膜能够通过内吞噬作用吸收这种DNA 颗粒。

1993年Golovkin 等用PEG 法将H89 的原生质体与含有鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)突变基因(氨甲喋呤抗性)的质粒共培养,此基因插入了玉米Ds1 转座子,用氨甲喋呤筛选得到的愈伤组织,在不含激素的培养基上再生出植株。1993年Omirulleh 等用PEG 法将外源基因导入到由HE89 的悬浮细胞系分离得到的原生质体,建立了植株再生的转化体系。

PEG 法转化效率较高,但必须以裸露的原生质体为受体,而且还受到基因型的限制。

脂质体法是用带正电荷的脂质体作载体携带外源基因,与带负电荷的细胞膜融合,把外源基因导入细胞。用脂质体法转化原生质体,其毒性较电击法和PEG 法小,且适于运输大分子DNA 穿过质膜。

Antonelli 等(1990)用该法将基因组DNA 转入BMS 玉米原生质体,获得转化的再生愈伤组织,转化率高达8%。

脂质体法的优点是转化受体为单个细胞,易于筛选,不易形成嵌合体,对于原生质体再生能力好的植物品种,是非常好的转化方法。

此外,人们也尝试用子房注射法、超声波转化法、带壁组织直接电击法等,但这些方法在操作的简便性和可重复性方面各有其欠缺,没有得广泛的应用。碳化硅晶体纤维法以其操作的简单性也许会有前途,但还需进一步研究。

(曹修岭  于嘉林 中国农业大学)

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